Социально-методический центр поддержки СО НКО Московской области

Коллекции

• Наука/Интерпериодика [СБУ] [1272]

Кинетика вируса гриппа A/BANGKOK/1/1979(Н3N2) Термическая инактивация в присутствии полиаллиламина

• Список журналов
• Коллекция чрезвычайных ситуаций в области общественного здравоохранения Nature
• PMC8129961

Бюлл. биолог. наук Московского ун-та. 2021; 76(1): 34–38.

Published online 2021 May 18. doi: 10.3103/S0096392521010028

, ^{1, 2} , ² , ² , ³ and ²

Author information Article notes Copyright and License информация Отказ от ответственности

В настоящее время полиэлектролиты играют все более важную роль в антивирусной терапии. Противовирусная активность в отношении вирусов гриппа, кори, вируса простого герпеса 1 типа и цитомегаловируса была продемонстрирована для полиэлектролита полиаллиламина с молекулярной массой 6000 Да. Ранее была определена нетоксичная концентрация полиаллиламина 30 мкМ, при которой соединение сохраняет свое противовирусное действие в отношении вирусов кори и гриппа, но не оказывает токсического действия на клетки человека. В то же время хорошо известно, что одновременное воздействие на вирус физических факторов внешней среды и химических веществ вызывает более значительное снижение инфекционности вируса. К числу таких физических факторов относится температура, поскольку тепловое воздействие вызывает инактивацию вируса. Анализ параметров термической инактивации вирусов имеет большое практическое значение при разработке вакцин против вируса гриппа и изучении снижения инфекционности вирусных частиц на различных поверхностях. В связи с этим особый интерес представляет изучение кинетических и термодинамических характеристик термической инактивации вируса гриппа в присутствии противовирусного препарата полиаллиланим. В работе сообщается, что термическая инактивация вируса гриппа в интервале температур 38–60°С в присутствии полиаллиламина протекает по кинетике реакции первого порядка. Термодинамические параметры термической инактивации вируса гриппа свидетельствуют о вовлечении в процесс инактивации поверхностных белков вируса гриппа в результате их взаимодействия с полиаллиламином. Полученные результаты показывают, что полиаллиламин может быть использован для ускорения термической инактивации вируса гриппа.

Ключевые слова: полиэлектролит, полиаллиламин, вирус гриппа, термическая инактивация, гемагглютинирующая активность, вирусная инфекционность

В целях снижения поствакцинальных осложнений требования, предъявляемые к инактивированным гриппозным вакцинам, ужесточаются. Для инактивации вируса гриппа применяют различные физические, химические и биологические методы [1–4]. Применение только физических методов часто недостаточно для инактивации вакцинного штамма вируса, поэтому применяют также различные химические соединения, инактивирующие вирусные антигенные белки, в частности гемагглютинин, при повышенных температурах. Это снижает гемагглютинирующую активность (ГА) вируса и его инфекционность. В настоящей работе полиэлектролиты (ПЭ) полиаллиламины (ПАА) с молекулярной массой 6000 Да, для которых ранее было показано противовирусное действие в отношении вирусов кори и гриппа в концентрации 30 мкМ [5], проявляющееся снижение их инфекционности без токсического действия на клетки, использовали в качестве химического соединения.

Вирус гриппа. Штамм вируса гриппа А/БАНГКОК/1/1979(Н3N2) получен из коллекции НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова (Москва, Россия) в виде вируссодержащей суспензии. Материал хранили при –80°С.

Полиэлектролит. В работе использовали полиэлектролит, гидрохлорид полиаллиламина с M _w = 6000 Да, в конечной концентрации 30 мкМ (Sigma, США). Раствор ПАК в фосфатном буфере имел рН 7,4.

Культура клеток. Клетки эпителия почек собачьего кокер-спаниеля MDCK II выращивали в среде DMEM с добавлением пенициллина (100 ЕД/мл), стрептомицина (100 мкг/мл) и 10% эмбриональной телячьей сыворотки в присутствии 5% СО ₂ при 37°С. Жизнеспособность клеток оценивали в МТТ-тесте [8]. Этот колориметрический анализ основан на способности живых клеток метаболизировать краситель тетразолия МТТ, что приводит к изменению его цвета. Интенсивность окрашивания определяли спектрофотометрически при 590 нм через 24 и 48 ч после добавления МТТ.

Гемагглютинирующая активность вируса. Активность НА вируса определяли в реакции гемагглютинации с использованием 1,5% взвеси куриных эритроцитов [9, 10]. Исходная активность ГК исследуемого штамма составила 32 ГАЕ/мл (единиц активности гемагглютинации/мл).

Вирусная инфекционность. Инфекционный титр вируса определяли по количеству фокусообразующих единиц (БОЕ) и выражали в БОЕ/мл [11]. Вирусную суспензию добавляли к монослою клеток MDCK II. Концентрация клеток в лунке 5 × 10 ⁴ кл. Множественность заражения составила 0,01. Заражение проводили при комнатной температуре в темноте в течение 1 ч, затем взвесь вируса удаляли. Далее клетки выращивали в среде DMEM-Avicel с добавлением 1,25 % микрокристаллической целлюлозы (Sigma, США), 0,36 % бычьего сывороточного альбумина и трипсина, обработанного ингибитором химотрипсина L-1-тозиламид-2-фенилэтилхлорметилкетона (Sigma, США) в концентрации 1 мкг/мл при 37°C в присутствии 5% CO ₂ . Через 29 ч культивирования культуральную жидкость сливали, а клетки фиксировали ледяным 70% этанолом в течение 90 мин. Затем клетки обрабатывали антителами мыши к белку NP вируса гриппа, а затем вторичными антителами против мыши, меченными пероксидазой хрена (Sigma, США). Для выявления пероксидазы хрена готовили два раствора: первый раствор, содержащий 2,5 мл диметилформамида и 10 мг 3-амино-9-этилкарбазола, и второй раствор, содержащий 0,2 мл H ₂ O ₂ в 0,2 М ацетатном буфере, рН 5,0. Два раствора смешивали и инкубировали при комнатной температуре в течение 20 мин. Затем планшет сканировали и рассчитывали количество БОЕ. Начальный инфекционный титр вируса составил 5,4 × 10 ⁶ БОЕ/мл.

Термическая инактивация вирусов. Термическую инактивацию вируса гриппа проводили в отсутствие и с добавлением ПАК к вируссодержащей суспензии до конечной концентрации 30 мкМ. Инкубацию проводили в интервале температур 45–60°С для расчета снижения ГК (ГАЕ, %) по отношению к исходной ГК, принятой за 100%, в течение 60 мин и при 38–60°С для расчета снижение инфекционного титра (БОЕ, %) по отношению к исходному инфекционному титру, принятому за 100%, в течение 180 мин. Все эксперименты с вирусом гриппа выполнены в лаборатории детских вирусных инфекций отдела вирусологии НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова. Статистическую обработку результатов, полученных в четырех повторностях каждого эксперимента, проводили с использованием параметрического критерия Стьюдента 9.0062 t — тест с доверительной вероятностью 0,95 в Excel 2010 (Microsoft Office). Аппроксимацию кинетических кривых также выполняли в Excel 2010.

Кинетические кривые для НА вируса гриппа и инфекционного титра, представленные на рис., показывают, что термическая инактивация вируса в присутствии 30 мкМ ПАК соответствует кинетике реакции первого порядка:

1

2

, где R и R _в – активная и инактивированная формы вируса соответственно [ R _t ] – ГА вируса и инфекционный титр в момент времени t в ходе термической инактивации вируса в присутствии 30 мкМ ПАА, [ R ₀ ] – исходный ГА и инфекционный титр, а к _в – константа скорости термической инактивации, мин ^–1 , которую рассчитывали путем подгонки кинетических зависимостей термической инактивации к экспоненциальным функциям с экспоненциальным множителем – к _в т . Константы скорости термической инактивации в присутствии 30 мкМ ПАК и без ФЭ приведены на рис. Представленные результаты показывают, что константа скорости термической инактивации в присутствии 30 мкМ ПАК выше, чем константа скорости инактивации в отсутствие ФЭ. Это наблюдение может быть объяснено инактивирующим действием ПАА, который связывается с поверхностными белками вириона, тем самым способствуя термической инактивации, что приводит к увеличению скорости падения ГА и инфекционного титра вируса. Термодинамические параметры термической инактивации вируса в присутствии и без ПАК, энтальпия Δ H ^≠ and entropy Δ S ^≠ of activation, were calculated using the kinetic parameters of influenza virus thermal inactivation and the Eyring equation ():

3

where T is температура, k _b – постоянная Больцмана, 1,38 × 10 ^–23 Дж/К, ч – постоянная Планка, 6,62 × 10 ^‒34 Дж с.

Таблица 1.

Константы термической инактивации вируса гриппа без ПАК

Open in a separate window

Table 2.

Influenza virus thermal inactivation constants in the presence of 30 µM PAA

Открыть в отдельном окне

Энтальпия и энтропия активации ГА и инфекционность вируса в отсутствие ПАК составляли = –124,5 ± 8,1 кДж/моль и = –141,27 ± 4,6 кДж/моль и = 63,14 ± 1,8 кДж/(К моль) и = 104,75 ± 5,4 кДж/(К моль) соответственно. Энтальпия и энтропия активации ГА и инфекционность вируса в присутствии 30 мкМ ПАК были следующими: = –373,95 ± 14,7 кДж/моль и = –142,93 ± 4,8 кДж/моль и = 871,4 ± 21,2 кДж/(К моль) и = 160,44 ± 5,8 кДж/(К моль) соответственно. Полученные термодинамические параметры термической инактивации вируса можно интерпретировать следующим образом. Сильно отрицательная энтальпия активации HA и инфекционного титра указывает на инактивацию поверхностных белков вириона, при этом более низкие значения энтальпии активации инфекционного титра являются результатом исключительно белковых структур, а не вирусного рибонуклеопротеина, способствующих снижению инфекционной активности вируса. Высокоположительная энтропия активации наблюдается, когда инактивация поверхностных гликопротеинов вириона оказывает гидрофобное действие. Энтальпия активации термической инактивации вируса в присутствии 30 мкМ ПАА значительно выше для ГК и не показывает существенной разницы в инфекционном титре по сравнению с термической инактивацией без ПАА. Это может быть объяснено взаимодействием ПАК с поверхностными гликопротеинами вириона вируса гриппа, которые вносят дополнительный вклад в энергию термической инактивации. Почти одинаковые энтропии активации в случае инфекционного титра можно объяснить тем, что ПАК взаимодействует не только с поверхностными белками, но и с рибонуклеопротеидом вируса. Высокая положительная энтропия активации ГК при термической инактивации вируса в присутствии ПАК связана с дегидратацией поверхностных белков после их инактивации. Приращение молярной теплоемкости Δ c _p могут дать дополнительную информацию о вкладе ПАК в термодинамику дегидратации поверхностных гликопротеинов в процессе термической инактивации вируса. Зная энтропию активации и используя формулу (4), можно рассчитать прирост молярной теплоемкости ГА и инфекционного титра вируса в процессе термической инактивации вируса:

4

где — изменение энтропии активации при T и является изменением энтропии активации при T _m , T _m = 334 K.

Molar heat capacity increment Δ c _p values ​​were calculated as the slope coefficients of the linear approximation equations based on — графики зависимости. Получены отрицательные значения Δ c _p :0062 p 2 = –0,44 0,06 кДж/(К моль) для термоинактивации инфекционного титра НА и вируса гриппа соответственно. Отрицательный прирост молярной теплоемкости для ГК свидетельствует о том, что в присутствии 30 мкМ ПАК происходит переход «скрученная молекула – расплавленная обезвоженная глобула» [7]. Полученные данные соответствуют значениям энтропии активации, полученным для термической инактивации НА вируса.

Борьба с пандемиями вируса гриппа и других оболочечных респираторных вирусов, включая COVID-19, требует разработки новых средств профилактики ОРВИ, в том числе химических препаратов, оказывающих инактивирующее действие на все антигенные белки вируса. Особое внимание следует уделить одновременному использованию физических и химических факторов инактивации вируса. Наши результаты показывают, что применение ПАК в сочетании с повышенной температурой вызывает эффективную и достаточно быструю инактивацию вируса гриппа, при этом применяемый ФЭ оказывает инактивирующее действие на все поверхностные гликопротеины вириона. Использование ПАК вместе с температурной инактивацией вируса может найти применение в технологии инактивированных, в том числе цельновирионных, противогриппозных вакцин.

Работа выполнена при поддержке проекта Russian Academic Excellence Project 5-1.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Ни один из авторов не проводил экспериментов с участием животных или людей.

Контаров ORCID: https://orcid.org/0000-0003-0030-4867

Долгова ORCID: https://orcid.org/0000-0001-8985-7569

Погарская ORCID: https://orcid .org/0000-0003-3580-6277

Контарова ORCID: https://orcid.org/0000-0002-5550-7875

Юминова ORCID: https://orcid.org/0000-0002-7723-4038

Перевод Е. Мартыновой

1. Бхатиа С., Лаустер Д., Бардуа М., Людвиг К. Линейный полисиалозид превосходит дендритный аналоги для ингибирования инфекции вируса гриппа in vitro и in vivo. Биоматериалы. 2017; 138:22–34. doi: 10.1016/j.biomaterials.2017.05.028. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

2. Sundararajan A., Ganapathy R., Huan L., Dunlap J. Изменчивость вируса гриппа в восприимчивости к инактивации полифенолами граната определяется гликопротеинами оболочки. Противовирусный рез. 2010; 88: 1–9. doi: 10.1016/j.antiviral.2010.06.014. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

3. Туладар Э., Боукнегт М., Цвитеринг М.Х., Купманс М., Дуизер Э. Термическая стабильность структурно различных вирусов с доказанной или потенциальной связью с пищевыми продуктами безопасность. Дж. Заявл. микробиол. 2012; 112:1050–1057. doi: 10.1111/j.1365-2672.2012.05282.x. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

4. Ван, В., Сонг, Х.С., Келлер, П.В., Альварадо-Факундо, Э., Вассел, Р. и Вайса, К.Д., Конформационная стабильность гемагглютинина вирусов гриппа А H5N1 влияет на чувствительность к широко нейтрализующим стволовым антителам, J. Virol., 2018, vol. 92, нет. 12. [Бесплатная статья PMC] [PubMed]

5. Контаров Н.А., Ермакова А.А., Гребенкина Н.С., Юминова Н.В., Зверев В.В. Исследование противовирусной активности полиэлектролитов в отношении вируса гриппа. Вопр. вирусол. 2015;60:5–9. [PubMed] [Google Scholar]

6. Джоли М. Физико-химический подход к денатурации белков . Лондон: Академическая пресса; 1965. [Google Scholar]

7. Потехин С.А. Сканирующая микрокалориметрия при высоком давлении: новый метод изучения конформационных и фазовых превращений. Усп. биол. хим. 2018; 58: 285–312. [Академия Google]

8. Мосманн Т. Экспресс-колориметрический анализ клеточного роста и выживания: применение для анализа пролиферации и цитотоксичности. Дж. Иммунол. Методы. 1983; 65: 55–63. doi: 10.1016/0022-1759(83)

-4. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

9.